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線蟲Cas9表達(dá)載體
概述
CRISPR/Cas9（成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)蛋白9）系統(tǒng)極大地促進(jìn)了多種物種的體外和體內(nèi)基因抑制實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞內(nèi)，Cas9核酸酶與引導(dǎo)RNA（gRNA）形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過(guò)與基因組中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特異性。gRNA與靶位點(diǎn)通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因組中的靶位點(diǎn)。Cas9掃描基因組并切割與gRNA互補(bǔ)的序列，前提是這些序列跟隨著一段NGG前間區(qū)序列鄰近基序（PAM）。雙鏈DNA斷裂隨后被HDR或者NHEJ途徑修復(fù)，從而產(chǎn)生不同大小長(zhǎng)度的位點(diǎn)突變（堿基插入或缺失）。
使用一個(gè)一體化的同時(shí)表達(dá)Cas9和gRNA的載體，或者分開(kāi)表達(dá)Cas9和gRNA的載體，可以方便地在線蟲中進(jìn)行CRISPR/Cas9編輯。該載體系統(tǒng)屬于后者，包含一個(gè)線蟲密碼子優(yōu)化的Cas9基因。該基因位于一個(gè)可加強(qiáng)表達(dá)的人工啟動(dòng)子下游，并以一個(gè)包含polyA加尾信號(hào)序列的3’ UTR結(jié)尾。該載體系統(tǒng)可選擇廣泛性啟動(dòng)子（eft-3 和pie-1）、組織特異性啟動(dòng)子（spe-11、myo-2、myo-3和rab-3）、以及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（hsp16-2和hsp16-48）。
該載體可以被注射到線蟲的遠(yuǎn)端性腺，然后進(jìn)入生殖細(xì)胞細(xì)胞核。篩選突變后代，獲得突變可遺傳的基因敲除線蟲品系。該載體也可以單獨(dú)使用。注射線蟲性腺生產(chǎn)Cas9表達(dá)的線蟲品系。
關(guān)于該載體系統(tǒng)的更新信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。
| 參考文獻(xiàn) | 主題 |
|---|---|
| Genetics. 202:885 (2016) | DNA transformation in C. elegans |
| Curr Protoc Mol Biol. 129 (2019) | CRISPR/Cas9 vectors in C. elegans |
| Nat Methods. 10:741 (2013) | gRNA design for C. elegans |
亮點(diǎn)
我們的線蟲Cas9表達(dá)載體經(jīng)過(guò)優(yōu)化，在大腸桿菌中具有高拷貝復(fù)制能力，且對(duì)細(xì)胞具有高效轉(zhuǎn)染率。該載體表達(dá)的Cas9與gRNA結(jié)合后，可以在線蟲中有效地實(shí)現(xiàn)基因編輯
優(yōu)勢(shì)
技術(shù)簡(jiǎn)單：使用顯微注射即可把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，相比起病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過(guò)程更簡(jiǎn)單。.
突變可遺傳：通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在生殖細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，可以獲得穩(wěn)定的突變可遺傳的線蟲品系。
不足之處
基因拷貝數(shù)在不同細(xì)胞中呈現(xiàn)差異性：盡管成功的轉(zhuǎn)染可以在單個(gè)細(xì)胞里產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)，但不同細(xì)胞間卻有高度的差異性。在一些細(xì)胞中，質(zhì)?？截悢?shù)非常高，而在另外一些細(xì)胞卻是低拷貝甚至沒(méi)有。
PAM要求：CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)必須包含NGG序列（使用較多），也叫做PAM序列，位于gRNA識(shí)別序列3'末端。
關(guān)鍵元件
Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.
Synthetic intron: This is placed proximal to the promoter to enhance gene expression.
Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.
ORF: The open reading frame of your gene of interest, e.g. C. elegans codon-optimized Cas9 (CeCas9), is placed here.
unc-54 3’ UTR+polyA: Myosin-4 3’ UTR with downstream polyA from C. elegans. It allows transcription termination and polyadenylation of mRNA transcribed by Pol II RNA polymerase.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.
